自誘導培養基(lac啟動(dòng)子)(Auto-induction Medium)產(chǎn)品及特點(diǎn)
本產(chǎn)品是在pET專(zhuān)用生長(cháng)培養基的基礎上開(kāi)發(fā)而成的,它利用E.coli自身對培養 基中碳源和能源的調控利用機制,實(shí)現外源蛋白在細菌達到飽和期后的自動(dòng)誘發(fā)。
具有下列特點(diǎn):
1. 不需添加任何IPTG或相關(guān)誘導物,節約成本。
2. 免去了密切監控菌液密度的過(guò)程,尤其適合大規模篩選 。
3. 細菌生長(cháng)密度遠高于IPTG誘導表達系統 。
4. 外源蛋白表達量遠遠高于IPTG誘導表達系統。
5. 本產(chǎn)品即開(kāi)即用,操作簡(jiǎn)單 。
6. 與各種細胞培養容器兼容(如培養瓶、培養罐、深孔管、發(fā)酵罐等)。

自誘導培養基(lac啟動(dòng)子)(Auto-induction Medium)操作步驟

(一)獲得目的基因

1、通過(guò)PCR方法:以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板,按基因序列設計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)),PCR循環(huán)獲得所需基因片段。

2、通過(guò)RT-PCR方法:用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉錄形成cDNA第一鏈,以逆轉錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

(二)構建重組表達載體

1、自誘導培養基(lac啟動(dòng)子)(Auto-induction Medium)載體酶切:將表達質(zhì)粒用限制性?xún)惹忻?同引物的酶切位點(diǎn))進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

(三)  獲得含重組表達質(zhì)粒的表達菌種

1、 將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α,根據重組載體的標志(抗Amp或藍白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質(zhì)粒,雙酶切初步鑒定。

2、 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應篩選更多克隆,重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。

3、 以此重組質(zhì)粒DNA轉化表達宿主菌的感受態(tài)細胞。

(四)誘導表達

1、 自誘導培養基(lac啟動(dòng)子)(Auto-induction Medium)挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過(guò)夜培養。

2、按1∶50比例稀釋過(guò)夜菌,一般將1ml菌加入到含50mlLB培養基的300ml培養瓶中, 37℃震蕩培養至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大約需3hr)。

3、取部分液體作為未誘導的對照組,余下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為實(shí)驗組,兩組繼續37℃震蕩培養3hr。

4、分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉淀,用100μl 1%SDS重懸,混勻, 70℃10min。

5、離心12000g×1min,取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。

自誘導培養基常見(jiàn)種類(lèi)